
人源抗狂犬病毒糖蛋白III号表位链置换基因工程抗体研究
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收稿日期: 2016年04期
基金:重大新药创制“应急抗体药物研发技术平台”(2013ZX09304103001006)
Generation of Human ScFv Antibodies for Antigenic SiteⅢof Rabies VirusGlycoprotein from Antibody-phage Libraries by Chain Shuffling
作者和机构
作者简介
Accepted:2016-10-31
Funds:国家自然科学基金
狂犬病(Rabies)是由狂犬病毒(Rabies virus,RV)引起的急性传染病[ 1[1]俞永新.狂犬病和狂犬病疫苗[M].北京:中国医药科技出版社,2001.],狂犬病毒基因组编码5种主要蛋白(L、N、G、M1和M2),其中糖蛋白(G)是病毒与宿主细胞结合的配体,能诱导机体产生中和抗体,主要有I、II和III号中和性抗原位点[ 2]。根据世界卫生组织(WHO)推荐的处理原则,III级暴露应立即处理伤口并注射抗狂犬病毒免疫球蛋白(rabies immune globulin,RIG),随后接种狂犬病疫苗[ 3]。由于RIG1注释:阿达啊飒飒大 具有副反应,产品成本高,供应量有限并且存在潜在的血源性感染等缺陷,因此研发安全有效并能稳定放大生产的被动免疫制剂取代RIG用于狂犬病的暴露后预防是必要的。由于狂犬病毒糖蛋白有3个主要中和表位,单一表位的抗体不能起到广谱安全的中和效果,因此,研制具有广谱抗狂犬病毒中和活性的单克隆抗体,并将针对不同表位的中和抗体联合组成鸡尾酒式配伍制剂就显得尤为重要。利用重组人源单抗CR57和CR4098制备的单克隆抗体鸡尾酒可中和26株典型的狂犬街毒株[ 4,5],2008年Crucell公司开发的CR57和CR4098构成的单抗鸡尾酒CL184在菲律宾完成了II期临床[ 6]。本研究团队运用Fab噬菌体表面展示技术,在国际上首次获得5株针对狂犬病毒糖蛋白Ⅱ号表位的重组人源中和单抗[ 7]。
293T细胞、BHK-21细胞和昆虫细胞Sf9 购自美国细胞培养中心(ATCC)。噬菌体抗体库建库载体为pHAL14[8]。狂犬病毒CVS株、aG株由中国疾控制中心病毒病所狂犬室提供。维尔博人用狂犬病纯化疫苗(vero细胞)购自法国赛诺菲巴斯德公司。RNA提取试剂盒、RT-PCR盒、PCR 试剂盒均购自Roche公司。胰酶、聚乙二醇(PEG)、转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)购自美国Sigma公司[ 补充资料]。
材料与方法
1 细胞、载体、病毒、疫苗
293T细胞、BHK-21细胞和昆虫细胞Sf9 购自美国细胞培养中心(ATCC)。噬菌体抗体库建库载体为pHAL14[8]。狂犬病毒CVS株、aG株由中国疾控制中心病毒病所狂犬室提供。维尔博人用狂犬病纯化疫苗(vero细胞)购自法国赛诺菲巴斯德公司。RNA提取试剂盒、RT-PCR盒、PCR 试剂盒均购自Roche公司。胰酶、聚乙二醇(PEG)、转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)购自美国Sigma公司。
2 细胞、载体、病毒、疫苗
293T细胞、BHK-21细胞和昆虫细胞Sf9 购自美国细胞培养中心(ATCC)。噬菌体抗体库建库载体为pHAL14[8]。狂犬病毒CVS株、aG株由中国疾控制中心病毒病所狂犬室提供。维尔博人用狂犬病纯化疫苗(vero细胞)购自法国赛诺菲巴斯德公司。RNA提取试剂盒、RT-PCR盒、PCR 试剂盒均购自Roche公司。胰酶、聚乙二醇(PEG)、转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)购自美国Sigma公司。
3 细胞、载体、病毒、疫苗
293T细胞、BHK-21细胞和昆虫细胞Sf9 购自美国细胞培养中心(ATCC)。噬菌体抗体库建库载体为pHAL14[8]。狂犬病毒CVS株、aG株由中国疾控制中心病毒病所狂犬室提供。维尔博人用狂犬病纯化疫苗(vero细胞)购自法国赛诺菲巴斯德公司。RNA提取试剂盒、RT-PCR盒、PCR 试剂盒均购自Roche公司。胰酶、聚乙二醇(PEG)、转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)购自美国Sigma公司[ 补充音频]。
结果
1、抗狂犬病毒糖蛋白III号表位轻链置换抗体库筛选
293T细胞、BHK-21细胞和昆虫细胞Sf9 购自美国细胞培养中心(ATCC)。噬菌体抗体库建库载体为pHAL14[8]。狂犬病毒CVS株、aG株由中国疾控制中心病毒病所狂犬室提供。维尔博人用狂犬病纯化疫苗(vero细胞)购自法国赛诺菲巴斯德公司。RNA提取试剂盒、RT-PCR盒、PCR 试剂盒均购自Roche公司。胰酶、聚乙二醇(PEG)、转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)购自美国Sigma公司。
2、抗狂犬病毒糖蛋白III号表位轻链置换抗体库筛选
293T细胞、BHK-21细胞和昆虫细胞Sf9 购自美国细胞培养中心(ATCC)。噬菌体抗体库建库载体为pHAL14[8]。狂犬病毒CVS株、aG株由中国疾控制中心病毒病所狂犬室提供。维尔博人用狂犬病纯化疫苗(vero细胞)购自法国赛诺菲巴斯德公司。RNA提取试剂盒、RT-PCR盒、PCR 试剂盒均购自Roche公司。胰酶、聚乙二醇(PEG)、转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)购自美国Sigma公司[ 补充视频]。
3、抗狂犬病毒糖蛋白III号表位轻链置换抗体库筛选
293T细胞、BHK-21细胞和昆虫细胞Sf9 购自美国细胞培养中心(ATCC)。噬菌体抗体库建库载体为pHAL14[8]。狂犬病毒CVS株、aG株由中国疾控制中心病毒病所狂犬室提供。维尔博人用狂犬病纯化疫苗(vero细胞)购自法国赛诺菲巴斯德公司。RNA提取试剂盒、RT-PCR盒、PCR 试剂盒均购自Roche公司。胰酶、聚乙二醇(PEG)、转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)购自美国Sigma公司。
293T细胞、BHK-21细胞和昆虫细胞Sf9 购自美国细胞培养中心(ATCC)。噬菌体抗体库建库载体为pHAL14[8]。狂犬病毒CVS株、aG株由中国疾控制中心病毒病所狂犬室提供。维尔博人用狂犬病纯化疫苗(vero细胞)购自法国赛诺菲巴斯德公司。RNA提取试剂盒、RT-PCR盒、PCR 试剂盒均购自Roche公司。胰酶、聚乙二醇(PEG)、转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)购自美国Sigma公司( 表1)。
293T细胞、BHK-21细胞和昆虫细胞Sf9 购自美国细胞培养中心(ATCC)。噬菌体抗体库建库载体为pHAL14[8]。狂犬病毒CVS株、aG株由中国疾控制中心病毒病所狂犬室提供。维尔博人用狂犬病纯化疫苗(vero细胞)购自法国赛诺菲巴斯德公司。RNA提取试剂盒、RT-PCR盒、PCR 试剂盒均购自Roche公司。胰酶、聚乙二醇(PEG)、转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)购自美国Sigma公司[ 补充图1]。
293T细胞、BHK-21细胞和昆虫细胞Sf9 购自美国细胞培养中心(ATCC)[ 补充表1]。噬菌体抗体库建库载体为pHAL14[8]。狂犬病毒CVS株、aG株由中国疾控制中心病毒病所狂犬室提供。维尔博人用狂犬病纯化疫苗(vero细胞)购自法国赛诺菲巴斯德公司。RNA提取试剂盒、RT-PCR盒、PCR 试剂盒均购自Roche公司。胰酶、聚乙二醇(PEG)、转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)购自美国Sigma公司( 图1)。

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doi:10.165408/j.cnki.11-5866/n.2016.03.001
孙丽娜,刘洋,李川,李德新,梁米芳 人源抗狂犬病毒糖蛋白III号表位链置换基因工程抗体研究 2016,20 (4),393-398
文章段落 19
参考文献×
[1]俞永新.狂犬病和狂犬病疫苗[M].北京:中国医药科技出版社,2001.
为获得针对狂犬病毒糖蛋白III号表位的人源单抗,本研究采用噬菌体展示平台,对一株狂犬病毒糖蛋白III号抗原表位的人源单抗CR4098采用链置换法进行改造。以CR4098单链抗体为骨架,从狂犬疫苗接种者外周血分离淋巴细胞,提核酸逆转录,PCR扩增抗体轻链可变区基因,替换CR4098的轻链基因,构建轻链置换文库。经 纯化狂犬病毒aG株富集筛选,以上述筛选出的轻链阳性克隆为骨架,构建重链置换抗体库,富集筛选后过A和IFA鉴定阳性抗体克隆并进行序列测定。利用IgG表达载体VH/VK双质粒系统瞬时转染293T细胞实现IgG抗体的分泌型表达,通过亲和力测定和中和试验鉴定IgG抗体功能。结果显示,通过轻链置换,我们获得 14株抗狂犬病毒scFv抗体,通过ELISA、IFA、亲和力测定及中和试验确定人源抗体RV3A5异性结合狂犬病毒 糖蛋白,对狂犬病毒CVS株和aG株均具有良好的中和活性,亲和力达到2.8×10-9 M。通过竞争ELISA对抗体 结合表位进行鉴定,结果表明RV3A5特异性识别糖蛋白III号抗原表位。通过链置换法成功获得1株全新的针对 狂犬病毒糖蛋白III号表位的高亲和力人源中和抗体,为狂犬病毒抗体制剂鸡尾酒治疗奠定了基础。
为获得针对狂犬病毒糖蛋白III号表位的人源单抗,本研究采用噬菌体展示平台,对一株狂犬病毒糖蛋白III号抗原表位的人源单抗CR4098采用链置换法进行改造。以CR4098单链抗体为骨架,从狂犬疫苗接种者外周血分离淋巴细胞,提核酸逆转录,PCR扩增抗体轻链可变区基因,替换CR4098的轻链基因,构建轻链置换文库。经 纯化狂犬病毒aG株富集筛选,以上述筛选出的轻链阳性克隆为骨架,构建重链置换抗体库,富集筛选后过A和IFA鉴定阳性抗体克隆并进行序列测定。利用IgG表达载体VH/VK双质粒系统瞬时转染293T细胞实现IgG抗体的分泌型表达,通过亲和力测定和中和试验鉴定IgG抗体功能。结果显示,通过轻链置换,我们获得 14株抗狂犬病毒scFv抗体,通过ELISA、IFA、亲和力测定及中和试验确定人源抗体RV3A5异性结合狂犬病毒 糖蛋白,对狂犬病毒CVS株和aG株均具有良好的中和活性,亲和力达到2.8×10-9 M。通过竞争ELISA对抗体 结合表位进行鉴定,结果表明RV3A5特异性识别糖蛋白III号抗原表位。通过链置换法成功获得1株全新的针对 狂犬病毒糖蛋白III号表位的高亲和力人源中和抗体,为狂犬病毒抗体制剂鸡尾酒治疗奠定了基础。